Endüstriyel uygulamar için scytalidium thermophilum ksilanazının tarımsal atıklar kullanılarak üretimi, saflaştırılması, karakterizasyonu ve X-ışını yapı analizi amacıyla kristalizasyonu

Bu çalışmada, termofilik bir küf olan Scytalidium thermophilum’dan ksilanaz üretim koşulları, Box-Behnken deney tasarım yöntemi kullanılarak tepki yüzey metodolojisi ile istatistiksel olarak optimize edilmiştir. Çalışılan aralıkta en uygun fermantasyon koşulu 1 ml aşı oranı, 50°C sıcaklık, 7,0 pH, 20 g/l mısır koçanı ve 5 g/l maya özütü olarak belirlenmiştir. Optimum koşullarda gerçekleştirilen fermantasyon sonucunda 134,09 IU/ml ksilanaz aktivitesi tespit edilmiştir. Bu sonucun, geliştirilen model eşitliğinden hesaplanan 133,91 IU/ml değeriyle uyumlu olduğu belirlenmiştir. Optimizasyon çalışmaları sonucunda enzim üretimi, başlangıç seviyesinin yaklaşık 2 katına çıkarılmıştır. Ksilanazın kısmi saflaştırılması amonyum sülfatla çöktürme, sulu iki faz ayrıştırma ve ultrafiltrasyon yöntemleri ile gerçekleştirilmiştir. Amonyum sülfatla çöktürme sonucunda %52 verimle 2,5 kat saflaştırma elde edilirken, sulu iki faz ayrıştırma tekniğinde %79 verim ve 2,7 kat, ultrafiltrasyon tekniğinde ise %25 verimle 4,3 kat saflaştırma elde edilmiştir. Ksilanazın tam saflaştırılması için jel filtrasyon ve anyon değişim kolon kromatografi teknikleri kullanılmış, enzim %9,6 verimle 21,8 kat saflaştırılmıştır. Ksilanazın molekül ağırlığı ve izoelektrik noktası sırasıyla 21 kDa ve pH 8,6 olarak bulunmuştur. Ham ksilanaz için optimum sıcaklık ve pH değerleri sırasıyla 70°C ve pH 7,0 olarak tespit edilmiştir. Saf ksilanaz için ise bu değerler sırasıyla 65°C ve pH 6,5 olarak bulunmuştur. Hem ham hem de saf enzim alkali pH koşullarında daha yüksek aktivite göstermiş ve her iki enzim formu da 60ºC’de 1 saatlik inkübasyon sonunda aktivitesinin yaklaşık %50’sini korumuştur. Saf enzimin Km ve Vmax değerleri sırasıyla 2,2±0,06 mg ksilan/ml ve 168,2±4,2 olarak tespit edilmiştir. Substrat seçiciliği incelemesi sonucunda ksilanazın, denenen lignoselülozik substratlar içinde en yüksek afiniteyi buğday kepeğine karşı gösterdiği belirlenmiştir. Ksilanazın biyokütle hidroliz potansiyeli mısır koçanı üzerinde araştırılmış ve enzimatik hidroliz sonucunda mısır koçanının morfolojisinde ortaya çıkan belirgin değişimler SEM analizi ile gözlemlenmiştir. Projenin son basamağı ise saf ksilanazın X-ışını analizi amacıyla kristalizasyonunu içermektedir. Optimize edilen kristalizasyon koşullarında S. thermophilum ksilanazı hem boyutsal hem de yapısal açıdan X-ışını analizine uygun bir kristal olarak elde edilebilmiştir

In this study, xylanase production conditions from a thermophilic fungus, Scytalidium thermophilum, were statistically optimized with Response Surface Methodology by using Box-Behnken experimental design method. Optimum fermentation conditions were determined as 1 ml inoculum level, 50°C temperature, 7.0 pH, 20 g/l corn cob and 5 g/l yeast extract within the working range. As a result of the fermentation at optimum conditions, 134.09 IU/ml xylanase activity was observed. This result was found to be in agreement with the calculated value of 133.91 IU/ml from the proposed model equation. As the result of the optimization studies, enzyme production was increased to 2 fold of the initial level. Partial purification of xylanase was studied using ammonium sulphate precipitation, aqueous two phase separation and ultrafiltration methods. After ammonium sulphate precipitation 2.5 fold purification with 52% yield was obtained, where 4.3 fold purification with 25% yield was obtained by ultrafiltration. For complete purification of xylanase, gel filtration and anion exchange chromatographic techniques were used and the enzyme was purified 21.8 fold with 9.6% yield. Molecular weight and isoelectric point of xylanase were determined as 21 kDa and pH 8.6, respectively. Optimum temperature and pH values for crude xylanase were found as 70°C and pH 7.0, respectively. These values for purified xylanase were determined as 65°C ve pH 6.5, respectively. Both crude and purified xylanase showed higher activity at alkali pH conditions and both of the enzyme forms retained about 50% of its activity after 1 h incubation at 60ºC. Km and Vmax values of the purified enzyme were found as 2.2±0.06 mg xylan/ml and 168.2±4.2, respectively. As a result of the substrate specificity study, it was determined that xylanase showed highest affinity towards wheat bran among the lignocellulosic substrates tested. Biomass hydrolysis potential of xylanase was studied on corn cob and apparent morphological changes in the corn cob structure were observed by SEM analysis. The last step of the project covered X-ray crystallography of the purified xylanase. S.thermophilum xylanase was obtained as a suitable crystal for X-ray crystallography in terms of size and structure, at the optimized crystallization conditions.